PolFEL 1.1 - Stacja badań biomedycznych

STACJA BADAŃ BIOMEDYCZNYCH
Agenda badawcza Polskiego Lasera na Swobodnych Elektronach określiła jako wiodącą dla projektu Krajową Inteligentną Specjalizację Nr 1: Zdrowe Społeczeństwo, szczególnie w obszarach Badania i rozwój produktów leczniczych oraz Technologie medyczne. Jednym z narzędzi realizacji badań w tym kierunku jest przewidziana do wykonania w ramach fazy 1 budowy PolFELa, nakierowana na badania z zakresu biochemii i biofizyki stacja badawcza IR. Jej zastosowania ograniczone są jednak do zakresu widmowego podczerwieni. W trakcie planowania i realizacji fazy I, ujawniono, że równie interesujący program badawczy w obszarze nauk biologiczno-medycznych może być prowadzony w dostępnym dla lasera PolFEL zakresie widmowym nadfioletu oraz promieniowania THz. Jego realizacja wymaga jednak budowy osobnej stacji badawczej dedykowanej do tego zakresu i spełniającej charakterystyczne dla niego wymagania techniczne, co nie jest i nie było możliwe ze względu na ograniczenia budżetowe i programowe fazy 1. Wnioskowana stacja badawcza wypełnia tę lukę. Stacja badań biomedycznych zostanie wyposażona w następujące układy pomiarowe:

• układ do obrazowania próbek biomedycznych w promieniowaniu THz
• układ do pomiaru kinetyki reakcji biochemicznych (układ Stopped-Flow/Pump-Probe)

Układ do obrazowania próbek biomedycznych w promieniowaniu THz zostanie wyposażony w skaningowy mikroskop pola bliskiego (SNOM – Scanning Near-Field Optical Microscopy). Urządzenie tego typu pozwala na złamanie limitu dyfrakcyjnego występującego w optyce. Częstotliwości fali elektromagnetycznej 0.5 THz do 3 THz generowanej w instalacji PolFEL odpowiada długość fali od 600 µm do 100 µm. W typowej mikroskopii optycznej limit dyfrakcyjny obrazowania to połowa długości fali, czyli w naszym przypadku od 300 µm do 50 µm. Zobrazowanie detali, które są mniejsze od 50 µm byłoby niemożliwe przy użyciu fali 3 THz. Wielkość większości komórek biologicznych waha się od kilkuset nanometrów do kilku mikrometrów, zatem znacznie poniżej możliwości obrazowania na zwykłym mikroskopie THz. Ograniczenia te nie występują w mikroskopach typu SNOM, gdzie za pomocą mikrosondy sczytuje się pola elektromagnetyczne w bliskim otoczeniu obiektu. Rozmiar mikrosond wacha się od kilkuset nanometrów do kilku mikrometrów, tak więc rozdzielczość skanowanego obrazu jest proporcjonalna do rozmiarów mikrosondy oraz długości fali padającego promieniowania. Dla częstotliwości THz możliwe jest uzyskanie rozdzielczości kilku do kilkunastu mikrometrów pozwalające na zobrazowanie komórek biologicznych.

Obrazowanie THz jest doskonałym narzędziem w diagnostyce nowotworowej, ponieważ pozwala nie tylko na zobrazowanie, ale także identyfikację tkanki nowotworowej w otocze zdrowej tkanki, z racji różnych koncentracji wody w obu tkankach. Urządzenie mikroskopowe SNOM z pomocą wiązki laserowej z zakresu THz wygenerowanej w instalacji PolFEL, pozwoli z większą niż dotychczas rozdzielczością zobrazować komórki rakowe w tkankach. Urządzenie SNOM będzie również pomocne w opracowaniu technik i metod, które można zastosować do wykrywania i śledzenia nanocząstek w komórkach biologicznych. Metodę można zastosować do ilościowego mapowania lokalnego stężenia nośnika w komórkach biologicznych.

Układ do pomiaru kinetyki reakcji biochemicznych będzie składał się z kilku podmodułów:

• system zatrzymanego przepływu Stopped-Flow z systemem/systemami detekcji, umożliwiającymi pomiary fluorescencji przy pobudzeniu wiązką PolFEL z undulatora VUV, wyposażony w dodatkową drobną aparatura pomocnicza: pH-metr, termostat, wirówka itp.
• układ spektroskopii Pump-Probe pomiaru zaniku fluorescencji współpracujący z wiązką PolFEL z undulatora VUV jako wiązką pobudzającą próbkę biochemiczną
• dodatkowego układu wzmacniaczy parametrycznych (z ang.: OPA – Optical Parametric Amplifier) do lasera optycznego współpracujący z obu powyższymi układami pozwalające na: wstępną kalibrację i pomiary przygotowujące do pomiarów z wiązką PolFEL oraz na pobudzenie kryształu nieliniowego w układzie spektroskopii pump-probe z up-konwersją.

Oba układy wyposażone zostaną w odpowiednie stoły laboratoryjne/optyczne, części zamienne i zużywalne (kuwety, elektrody, plastiki) oraz odczynniki do eksperymentów testowych (białka/peptydy, ligandy itp.)

Metoda zatrzymanego przepływu (z ang.: stopped-flow) jest powszechnie stosowaną techniką badawczą, umożliwiającą śledzenie postępu reakcji (bio)chemicznej, zachodzącej w czasie powyżej 1 ms po zmieszaniu reagentów. Większości reakcji biochemicznych towarzyszy zmiana stanu parametrów układu możliwa do obserwacji w szerokim zakresie promieniowania elektromagnetycznego (od UV, poprzez Vis aż do IR). Jednakże głównym ograniczeniem jest czułość pomiaru, będąca bezpośrednią konsekwencją niskich stężeń stosowanych w przeważnie wodnych roztworach układów bimolekularnych. Z tego powodu istotne jest zastosowanie ekstremalnie silnych impulsowych źródeł optycznych, które nie zniszczą próbki, a pozwolą na efektywne wzbudzenie przejść elektronowych i/lub oscylacyjnych. Ze względu na wspomniane rozcieńczenie próbek, ich oddziaływanie z promieniowaniem jest znikome. Synchronizacja układu stopped-flow z impulsami lasera FEL oraz impulsami z wzmacniaczy OPA pozwoli zarówno na szeroki zakres pobudzania próbek od zakresu głębokiego ultrafioletu (od około 170 nm z linii VUV lasera PolFEL) jak i zachowanie wysokiej energii impulsów laserowych.

Układ spektroskopii pump-probe będzie służył do pomiaru czasu zaniku fluorescencji od kilku pikosekund do kilku mikrosekund. W układzie tym próbka będzie pobudzana albo za pomocą impulsu VUV z lasera PolFEL (od około 170 nm) jak i z jednego z wzmacniacza parametrycznego OPA. W zakresie pomiarowym od kilku pikosekund do kilku nanosekund wzbudzona w próbce fluorescencja będzie mieszana w krysztale nieliniowym z sygnałem bramkującym z drugiego wzmacniacza parametrycznego opóźnionego względem impulsu pobudzającego przez linię opóźniającą. Tak zmieszane ze sobą promieniowanie elektromagnetyczne będzie padało na detektor. Ten typ badania spektroskopowego nazywa się spektroskopią pump-probe z up-konwersją, gdzie detekcja odbywa się na sygnale fluorescencyjnym zmieszanym z sygnałem bramkującym w odpowiednim momencie czasu. W zakresie pomiarowym od kilku nanosekund do kilku mikrosekund pomiar fluorescencji odbywa się w procesie zliczania pojedynczych fotonów skorelowanych czasowo (z ang. TCSPC – Time Correlated Single Photon Counting), gdzie czas opóźnienia jest dobierany elektronicznie na bardzo szybkich detektorach. Powyższy układ pozwoli na pomiar zaniku fluorescencji w zakresie spektralnym od ultrafioletu (od około 300 nm) do bliskiej podczerwieni (do około 1500 nm dla upkonwersji oraz do ok 800 nm dla TCSPC).

Zagadnienia badawcze układu do pomiaru kinetyki reakcji biochemicznych, których realizacja zostanie umożliwiona lub pogłębiona dzięki utworzeniu powyższej aparatury, obejmują:

• procesy agregacji białek i peptydów, leżące u podłoża chorób związanych ze starzeniem i cywilizacyjnych, w tym choroby Alzheimera i Parkinsona, a także cukrzyca typu II;
• mechanizmy zwijania białek i oddziaływań międzycząsteczkowych typu białko/białko i białko/kwas nukleinowy istotne dla poszukiwania terapii dla chorób genetycznych, takich jak mukowiscydoza i uwarunkowane genetycznie choroby nowotworowe;
• oddziaływania białek z małymi cząsteczkami dla modelowania mechanizmów działania leków;
• oddziaływania jonów metali fizjologicznych i toksycznych z białkami dla zrozumienia podstaw molekularnych chorób cywilizacyjnych związanych ze skażeniem środowiska, takich jak alergie i nowotwory.

Budowa stacji badań biomedycznych w zaprojektowanym kształcie pozwoli także na wykorzystanie infrastruktury PolFEL do prowadzenia prac badawczych nad strukturą i interakcją wirusów, w tym< koronawirusów, takich jak SARS-CoV-2 i jego odmiany.

Jednym ze zidentyfikowanym kierunków prac mogłoby być wykorzystanie zjawiska miękkiej (słabej) ablacji materiału biologicznego lub biochemicznego zachodzącego pod wpływem intensywnej wiązki niejonizującego promieniowania lasera na swobodnych elektronach (taki charakter ma promieniowanie PolFELa w całym dostępnym dla niego zakresie spektralnym), szczególnie wiązki THz, w połączeniu z zastosowaniem technik spektroskopowych, wielokierunkowych technik pomiarowych (w  tym – technik obrazujących) oraz metody pompa-sonda do analizy uwolnionego aerozolu. Obiecującym kierunkiem badań rozwijanych na świecie w ostatnich latach jest również zastosowanie metamateriałów do konstrukcji terahercowych biosensorów. Wspólnym mianownikiem wspomnianych metod i kierunków badawczych jest znacząca, przynajmniej o rząd wielkości w stosunku do innych metod eksperymentalnych, poprawa czułości wykrywania i analizy materiału biochemicznego. Stwarza to potencjalną możliwość opracowania nowych szybkich, in situ i czułych metod wykrywanie materiału genetycznego wirusa w nanoskali.

W celu zapewnienia realizacji tego kierunku badań Narodowe Centrum Badań Jądrowych podpisało List Intencyjny o współpracy z Intytutem Wysokich Ciśnień PAN, który w ramach Projektu CENTERA rozwija kompetencje badawcze w obszarze promieniowania THz, łącząc je z wiedzą i możliwościami wytwórczymi w obszarze fizyki ciała stałego i metamateriałów. Otwiera to możliwość prowadzenia pełnego cyklu badań, począwszy od badań o charakterze podstawowym, poprzez weryfikację koncepcji, budowę i sprawdzanie kolejnych wersji biosensorów, aż po wytwarzanie kompletnych zestawów umożliwiających np. identyfikację materiału wirusa, gotowych do zastosowania w praktyce laboratoryjnej.